FGFR1基因敲除牛乳腺上皮细胞系的构建及功能研究

doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2026.01.029

中国畜牧兽医 ›› 2026, Vol. 53 ›› Issue (1): 317-332.doi: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2026.01.029

FGFR1基因敲除牛乳腺上皮细胞系的构建及功能研究

高林娜¹^,²(), 蒋影影¹^,³, 黄广军¹^,³, 王悦¹^,³, 史倩倩¹^,², 王慧利¹, 陈坤琳¹()

^1.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏省畜禽精准育种工程研究中心，农业农村部种养结合重点实验室，南京 210014
^2.河北工程大学生命科学与食品工程学院，邯郸 056038
^3.南京农业大学动物科技学院，南京 210095

收稿日期:2025-05-12 出版日期:2026-01-05 发布日期:2025-12-26
通讯作者: 陈坤琳 E-mail:13292751837@163.com;chenkunlin@jaas.ac.cn
作者简介:高林娜，E-mail：13292751837@163.com
基金资助:
国家自然科学基金(32472872)

Construction and Functional Study of FGFR1 Gene Knockout Bovine Mammary Epithelial Cell Line

GAO Linna¹^,²(), JIANG Yingying¹^,³, HUANG Guangjun¹^,³, WANG Yue¹^,³, SHI Qianqian¹^,², WANG Huili¹, CHEN Kunlin¹()

^1.Key Laboratory of Crop and Animal Integrated Farming，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Jiangsu Province Engineering Research Center for Precision Animal Breeding，Institute of Animal Science，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China
^2.School of Life Sciences and Food Engineering，Hebei University of Engineering，Handan 056038，China
^3.College of Animal Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China

Received:2025-05-12 Online:2026-01-05 Published:2025-12-26
Contact: CHEN Kunlin E-mail:13292751837@163.com;chenkunlin@jaas.ac.cn

摘要/Abstract

摘要：

目的利用CRISPR/Cas9技术构建成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1， FGFR1）基因敲除牛乳腺上皮细胞系（bovine mammary epithelial cells，bMECs），探究FGFR1基因缺失对细胞存活、增殖及泌乳功能的影响，以期揭示其在乳腺发育和泌乳中的分子调控机制。方法针对FGFR1基因的第3、4外显子分别设计sgRNA并在体外鉴定切割效率后，构建FGFR1基因敲除质粒；电转染bMECs，利用嘌呤霉素和稻温毒素筛选7 d，收集细胞提取基因组DNA，经PCR扩增与Sanger测序鉴定FGFR1基因编辑情况；利用有限稀释法从目标编辑细胞群中挑取单克隆细胞，借助TA克隆技术进一步筛选出具有单一基因型的FGFR1基因敲除细胞株；通过Western blotting检测单克隆细胞株的敲除效率，利用CCK-8法测定细胞活力，采用实时荧光定量PCR检测单克隆细胞株中增殖和泌乳相关基因的表达情况。结果体外切割试验显示，2条sgRNA的切割效率分别为82.87%和27.80%，表明成功构建敲除质粒。电转染72 h后发现超过95%的bMECs带有红色荧光，且药物筛选后编辑区域出现多个双峰，证明编辑效果明显。挑取384株单克隆细胞，扩繁92株细胞，其中72株细胞FGFR1基因被编辑（78.26%），31株sgRNA1位点发生编辑（33.70%），55株sgRNA2位点（59.78%）发生编辑，最终获得8株形态饱满、长势良好的FGFR1基因敲除单克隆细胞株。测序结果显示，单克隆细胞株编辑位点呈片段缺失和碱基替换等多种编辑形式，其中KO#2细胞株的2个位点均发生编辑，且仅有1种编辑类型；Western blotting和CCK-8结果显示，与对照组相比，KO#2株细胞敲除效果极显著（P<0.01），但敲除FGFR1基因对细胞活力无显著影响（P>0.05）。实时荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，敲除FGFR1基因后细胞增殖相关基因的表达量无显著差异（P>0.05），但泌乳合成相关基因的表达量显著或极显著降低（P<0.05；P<0.01）。结论本研究成功构建1株FGFR1基因敲除的bMECs，且敲除FGFR1基因对细胞存活及增殖无显著影响，但可显著抑制其泌乳合成功能，这为进一步研究FGFR1基因在bMECs中的功能和作用机制提供了依据。

关键词: FGFR1基因; 牛乳腺上皮细胞系（bMECs）; CRISPR/Cas9; 基因编辑; 泌乳调控

Abstract:

Objective This study aimed to establish a fibroblast growth factor receptor 1 （FGFR1） gene knockout bovine mammary epithelial cell line （bMECs） using CRISPR/Cas9 technology， and investigate the effects of FGFR1 gene deletion on cell viability， proliferation， and lactation function， thereby elucidating its molecular regulatory mechanisms in mammary gland development and lactation. Method sgRNAs were designed targeting exons 3 and 4 of FGFR1 gene. Following in vitro assessment of cleavage efficiency， a knockout plasmid for FGFR1 gene was generated. Genomic DNA was collected 7 d post-screening， and PCR amplification along with Sanger sequencing were employed to confirm FGFR1 gene editing. Monoclonal cells were isolated from the edited cell population using the limiting dilution method. FGFR1 gene knockout cell lines with a singular genotype were subsequently identified through TA cloning. The knockout efficiency of monoclonal cell lines was assessed via Western blotting， while cell viability was determined using CCK-8 assay. Additionally， Real-time quantitative PCR was utilized to evaluate the expression of genes associated with proliferation and lactation in the monoclonal cell lines. Result The in vitro cleavage assay demonstrated cleavage efficiencies of 82.87% and 27.80% for the two sgRNAs， confirming successful construction of the knockout plasmid. Subsequently， over 95% of bMECs displayed red fluorescence 72 h post-electrotransfection， with multiple double peaks observed in the target region following drug screening， indicating a pronounced editing effect. From a pool of 384 monoclonal cell lines， 92 were successfully propagated， with 72 （78.26%） exhibiting FGFR1 gene editing， 31 （33.70%） showing sgRNA1 site editing， and 55 （59.78%） displaying sgRNA2 site editing. Ultimately， 8 robust monoclonal cell lines were isolated. Sequencing analysis revealed diverse editing patterns among the monoclonal cell lines， including fragment deletions and base substitutions. Notably， the KO#2 cell line exhibited editing at two sites with a single editing type. Western blotting and CCK-8 results showed that compared with control group， the knockout effect of KO#2 strain cells was extremely significant （P<0.01）， while FGFR1 gene knockout did not significantly impact cell viability （P>0.05）. Real-time quantitative PCR analysis results revealed that compared with control group， there was no significant differences in the expression of genes associated with cell proliferation （P>0.05）. However， the significant reduction in the expression of genes related to lactation function was observed（P<0.05 or P<0.01）. Conclusion This study successfully constructed one strain of bMECs with FGFR1 gene knockout， indicate that the absence of FGFR1 gene did not notably impact cell survival and proliferation， but significantly inhibited lactation synthesis function. The results provided a basis for future investigations into the role and mechanisms of FGFR1 gene in bMECs.

Key words: FGFR1 gene; bovine mammary epithelial cell line （bMECs）; CRISPR/Cas9; gene editing; lactation regulation

中图分类号:

S823

高林娜, 蒋影影, 黄广军, 王悦, 史倩倩, 王慧利, 陈坤琳. FGFR1基因敲除牛乳腺上皮细胞系的构建及功能研究[J]. 中国畜牧兽医, 2026, 53(1): 317-332.

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图/表 12

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参考文献 45

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引物 Primers	引物序列 Primer sequences （5′→3′）	片段长度 Product length/bp
QG-FGFR1-sgRNA1	F：CTTCGCCTGTCTTCCTTTGC	511
	R：GGACTTGGCTACCCACCTGA	511
QG-FGFR1-sgRNA2	F：AACCCCACCTATCCGTGAT	583
	R：GCTCGCCACCTGTAAACAAT	583

基因 Genes	登录号 Accession No.	引物序列 Primer sequences （5′→3′）	片段长度 Product length/bp
GAPDH	NM_001034034	F：GGCAAGTTCAACGGCACAGT	129
GAPDH	NM_001034034	R： CACCACATACTCAGCACCAGC	129
PCNA	NM_001034494	F： CGGACACGTTGGCACTAGTATT	138
PCNA	NM_001034494	R： CAGAAGGCATCTTTACTACACAGC	138
CyclinD1	NM_001046273	F： CCTGGTGAACAAACTCAAGTGG	140
CyclinD1	NM_001046273	R： CACAGAGGGCAACGAAGGT	140
CyclinE1	NM_001192776	F： CGGATACCATGAAAGAGGAAAG	162
CyclinE1	NM_001192776	R： CTCTATTACTGTCCCAAGGCTGA	162
CSN1S1	NM_181029	F： GCGTTACCTGGGTTATCTGGA	141
CSN1S1	NM_181029	R： ATCATAGGTTCTTTCTGTTGGGC	141
CSN2	XM_015471671	F： CAGCCTGAAGTAATGGGAGTCT	205
CSN2	XM_015471671	R： ACATGACAGTTGGAGGAAGAGG	205
CSN3	NM_174294	F： ACCAATACGCTGTGAGAAAGATG	156
CSN3	NM_174294	R： GGGTATGGCAGAAATTGATTATT	156
ELF5	NM_001024569	F： GAAGCCCTGGCGAAGATGT	118
ELF5	NM_001024569	R： TTCGGTCAACCCGTTCCA	118
GLUT1	NM_174602	F： CCTGGATGTCCTACCTGAGC	178
GLUT1	NM_174602	R： CGCACAGTTGCTCCACATAC	178
HKⅡ	XM_015473383	F： AAGATGCTGCCCACCTACG	123
HKⅡ	XM_015473383	R： TCGCTTCCCATTCCTCACA	123
SCD-1	NM_173959	F： CGACCTAAGAGCCGAGAAGC	162
SCD-1	NM_173959	R： CCAAGGGCATAACGGAATAA	162

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Construction and Functional Study of FGFR1 Gene Knockout Bovine Mammary Epithelial Cell Line

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