坏死梭杆菌对奶牛真皮成纤维细胞线粒体动力学与自噬的影响

doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2026.01.037

摘要/Abstract

摘要：

目的探究坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum，Fnn）感染对奶牛真皮成纤维细胞（bovine dermal fibroblasts，BDFs）线粒体动力学与自噬的影响及其潜在机制。方法从奶牛趾间皮肤中分离培养BDFs，与1×10⁸ CFU/mL的Fnn共培养12 h建立感染模型组（Fnn），以未感染的细胞作为对照组（CON），观察Fnn感染后BDFs形态变化，通过CCK-8试剂盒检测BDFs细胞活性，实时荧光定量PCR检测线粒体动力学、生物合成以及线粒体自噬相关基因表达的变化，免疫荧光法检测相关蛋白表达的变化。结果与CON组相比，Fnn组细胞出现肿胀、体积增大的变形现象，Fnn感染可极显著抑制BDFs活性（P<0.01）。实时荧光定量PCR结果显示，与CON组相比，Fnn感染后BDFs的过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子α（PGC-1α）、核呼吸因子-1（Nrf1）、线粒体转录因子A（Tfam）、线粒体融合素基因-2（Mfn-2）、磷酸酶及张力蛋白同源物诱导的蛋白激酶1（PINK1）、E3泛素连接酶（Parkin）基因相对表达量显著或极显著下降（P<0.05；P<0.01），视神经萎缩蛋白1（Opa1）、Mfn-1、Sequestosome 1（P62）基因相对表达量有下降的趋势（P>0.05），线粒体裂变蛋白1（Fis1）、微管相关蛋白1轻链3α（LC3α）和LC3β基因相对表达量极显著升高（P<0.01）。免疫荧光法检测结果显示，与CON组相比，Fnn感染后，BDFs线粒体动力蛋白相关蛋白1（Drp1）、PINK1、Parkin、P62荧光信号增强，Opa1、Mfn-1、LC3荧光信号减弱。结论 Fnn感染可破坏BDFs线粒体生物合成，扰乱线粒体融合与分裂进程，诱导线粒体自噬的发生。本研究结果可为深入理解腐蹄病的发病机制提供新的理论依据。

关键词: 腐蹄病; 坏死梭杆菌; 线粒体生物合成; 线粒体动力学; 线粒体自噬

Abstract:

Objective This study was conducted to investigate the effects and potential mechanisms of Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum （Fnn） infection on mitochondrial dynamics and mitophagy of bovine dermal fibroblasts（BDFs）. Method This study isolated and cultured BDFs from the skin between cow toes and co-cultured them with 1×10⁸ CFU/mL Fnnfor 12 h to establish an infection model group （Fnn）. Uninfected cells were used as control group （CON）， the morphological changes of BDFs afterFnninfection were observed. The cell activity of BDFs was detected by CCK-8 kit. Real-time quantitative PCR was used to detect the changes in the expression of genes related to mitochondrial dynamics， biosynthesis and mitophagy， and immunofluorescence assay was used to detect the changes in the expression of related proteins. Result Compared with CON group， cells in Fnn group showed swelling， bulging， and deformation， and Fnn infection significantly inhibited the activity of BDFs. Real-time quantitative PCR results showed that compared with CON group， after Fnn infection， the relative expression levels of peroxisome proliferator receptor gamma coactivator alpha （PGC-1α）， nuclear respiratory factor-1 （Nrf1）， mitochondrial transcription factor A （Tfam）， mitochondrial fusion factor gene-2 （Mfn-2）， phosphatase and tensin homolog induced protein kinase 1 （PINK1）， E3 ubiquitin ligase （Parkin） genes in BDFs were significantly or extremely significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）， while the relative expression levels of optic nerve atrophy protein 1 （Opa1）， Mfn-1， and Sequetosome 1 （P62） genes showed a decreasing trend （P>0.05）. The relative expression of genes Fis1， light chain-3α （LC3α）and LC3β were extremely significantly increased （P<0.01）. The results of immunofluorescence assay detection showed that compared with CON group， after Fnn infection， the fluorescence signals of dynein related protein 1 （Drp1）， PINK1， Parkin and P62 in BDFs were enhanced， the fluorescence signals of Opa1， Mfn-1 and LC3 were weakened. Conclusion Fnn infection could disrupt the mitochondrial biosynthesis of BDFs， disrupt mitochondrial fusion and fission processes， and induce mitophagy. This results provided a new theoretical basis for a deeper understanding of the pathogenesis of hoof rot disease.

Key words: foot rot; Fusobacterium necrophorum subsp.necrophorum; mitochondrial biosynthesis; mitochondrial dynamics; mitophagy

中图分类号:

S852.61

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图/表 6

表1

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图5

参考文献 30

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引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequences （5′→3′）	登录号 Accession No.	退火温度 Annealing temperature/℃	产物长度 Product length/bp
PINK1	F：CTGCAGTTGCCTTTCACCAG	XM_061148080.1	57.6	185
PINK1	R：CCCTGGCCGTAAAAGGGATT	XM_061148080.1	57.6	185
Parkin	F：CTGGGACCAGAGCGGAATTT	XM_070795610.1	57.7	110
Parkin	R：GCAGCTGATGTCTCGACTGT	XM_070795610.1	57.7	110
P62	F：TCAGCTTCTGCTTTAGCCCG	XM_061149642.1	57.7	165
P62	R：AAAAGGCAACCAAGTCCCCA	XM_061149642.1	57.7	165
LC3α	F：CCACTCAGGCCTTCTTCCTG	XM_027558755.1	58.2	95
LC3α	R：ATCCTCGTCCTTCTCCTGCT	XM_027558755.1	58.2	95
LC3β	F：ATGCCGTCCGAGAAAACCTT	XM_061386957.1	57.3	112
LC3β	R：TTGCCATACTTCCTTCCGGG	XM_061386957.1	57.3	112
PGC-1α	F：GGACATGTGCAACCAGGACT	XM_045474382.1	57.8	65
PGC-1α	R：GGTCTTCACCAACCAGAGCA	XM_045474382.1	57.8	65
Nrf1	F：ATGACCATCCAGACAACGCA	XM_027539015.1	57.1	151
Nrf1	R：CCTCTTTTATTGCCCACCCCT	XM_027539015.1	57.1	151
Tfam	F：TGAATGCGCTGGGAAAGTCA	NM_001034016.2	57.1	71
Tfam	R：ACTAAAGGGATAGCGCAGTCG	NM_001034016.2	57.1	71
Opa1	F：GCCTGACATTGTGTGGGAGA	XM_045502573.1	57.7	159
Opa1	R：CCAGGTGAACCTGTGGTGAA	XM_045502573.1	57.7	159
Mfn-1	F：GCTGGGCTTCTCTTGTCCAT	XM_061415356.1	57.7	64
Mfn-1	R：AATCCTAGAAGCACCCGCTG	XM_061415356.1	57.7	64
Mfn-2	F：GGGCTCAGAGGAGAAGAGGA	XM_061160381.1	58.2	72
Mfn-2	R：AGCTGTTCGTCCTGGTGAAG	XM_061160381.1	58.2	72
Fis1	F：GCTGAACGAGTTGGTGTCTG	XM_059038717.2	56.7	157
Fis1	R：AGCAAGGCCTTTACGGATGT	XM_059038717.2	56.7	157
β-actin	F：TCCTGCGGCATTCACGAAACTAC	XM_027528015.1	60.7	80
β-actin	R：GTGTTGGCGTAGAGGTCCTTGC	XM_027528015.1	60.7	80